共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的比較

　　顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡同屬于光學(xué)顯微鏡。
　　一、普通光學(xué)顯微鏡
　　普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機(jī)械裝置，用于固定材料和觀察方便。
　　顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guān)，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體zui小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：
　　R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2
　　式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的zui大值必然小于1。
　　制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。
　　普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計(jì)的zui大放大倍數(shù)通常為1000X。
　　二、激光共聚焦掃描顯微境
　　激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope），用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
　　為什么需要共聚焦顯微鏡?
　　1.光學(xué)顯微鏡經(jīng)過了我們偉大的前人們的努力與改良，已經(jīng)臻于完善的地步。事實(shí)上，通常的顯微鏡可以簡單、快捷地為我們提供美麗的微觀圖像。但是，給這個近乎完善的顯微鏡世界帶來革命性創(chuàng)新的事件發(fā)生了，這就是“激光掃描型共聚焦顯微鏡”的發(fā)明。這種新型顯微鏡的特點(diǎn)是：采用僅將焦點(diǎn)所集中的面上的圖像情報提取出來的光學(xué)系統(tǒng)，通過改變焦點(diǎn)的同時將所獲得的信息在圖像存儲器內(nèi)復(fù)原，從而可以獲得具有*3維信息情報的鮮明的圖像。通過這個方法，可以簡單地獲得以通常的顯微鏡所無法確認(rèn)的、關(guān)于表面形狀的信息。另外，對于通常的光學(xué)顯微鏡來說，“提高分辨率”與“加深焦點(diǎn)深度”是相互矛盾的條件，尤其在高倍率時這個矛盾更為突出，但在共聚焦顯微鏡來講，這個難題迎刃而解。
　　2.共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)勢
　　激光共焦顯微鏡原理圖
　　共聚焦光學(xué)系統(tǒng)是對樣品進(jìn)行點(diǎn)照明，同時反射光也采用點(diǎn)感受器來受光。樣品被放置在焦點(diǎn)位置時，反射光幾乎全部可以到達(dá)感光器，樣品偏離焦點(diǎn)時，反射光無法到達(dá)感光器。也就是說，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，只有與焦點(diǎn)重合的圖象會被輸出，光斑、無用的散亂光都被屏蔽掉了。
　　3.為何用激光？
　　共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，對樣品進(jìn)行點(diǎn)照明、同時反射光亦采用點(diǎn)感光器受光。因此，點(diǎn)光源就成為必要。激光屬于非常的點(diǎn)光源。大多數(shù)情況下，共聚焦顯微鏡的光源都采用激光光源。另外，激光所具有的單色性、方向性以及優(yōu)異的光束形狀等特征，也是被廣泛采用的重要理由。
　　4.高速掃描基礎(chǔ)上的實(shí)時觀察成為可能
　　激光的掃描，其水平方向采用了聲控光學(xué)偏向單元（Acoustic Optical Deflector，AO素子）、垂直方向采用了伺服電控光束掃描鏡（Servo Galvano-mirror）。音響光學(xué)偏向單元由于不存在機(jī)械性震動部分，所以可以進(jìn)行高速的掃描， 在監(jiān)視畫面上實(shí)時觀察成為可能。這種攝像的高速性，是直接影響聚焦、位置檢索速度的非常重要的項(xiàng)目。
　　5.焦點(diǎn)位置和亮度的關(guān)系
　　共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，樣品被正確地放置在焦點(diǎn)位置時亮度為zui大，在它的前后，其亮度皆會銳減（圖4實(shí)線）。這種焦點(diǎn)面的敏感的選擇性，也正是共聚焦顯微鏡高度方向測定以及焦點(diǎn)深度擴(kuò)張的原理所在。相對于此，通常的光學(xué)顯微鏡則在焦點(diǎn)位置前后不會有明顯的亮度變化（圖4點(diǎn)線）。
　　6.高對比度、高分辨率
　　通常的光學(xué)顯微鏡，由于偏離焦點(diǎn)部分的反射光會發(fā)生干擾，它與焦點(diǎn)成像部分發(fā)生重疊，從而造成圖像對比度的降低。而相對于此，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，焦點(diǎn)以外的散亂光以及物鏡內(nèi)部的散亂光幾乎*被去除掉，因而可以獲得對比度非常高的圖像。另外，由于光線2次通過物鏡使得點(diǎn)像更加先銳化，也提高了顯微鏡的分辨能力。
　　7.光學(xué)局部化功能
　　共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，與焦點(diǎn)重合點(diǎn)以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在觀察立體樣品時，形成如同用焦點(diǎn)面對樣品進(jìn)行切片后形成的圖象（圖5）。這種效果被稱為光學(xué)局部化，屬于共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的特長之一。
　　8.焦點(diǎn)移動記憶機(jī)能
　　所謂焦點(diǎn)以外的反射光被微孔屏蔽掉，反過來看的話，可以認(rèn)為共聚焦光學(xué)系統(tǒng)所成的像上所有的點(diǎn)均與焦點(diǎn)重合。因此將立體樣品沿Z軸（光軸）方向移動的話，將圖像累積保存在存儲器內(nèi)，zui終就會獲得樣品全體與焦點(diǎn)重合而形成的圖像。以這種方法將焦點(diǎn)深度無限加深的機(jī)能稱做移動記憶機(jī)能。
　　9.表面形狀測定機(jī)能
　　焦點(diǎn)移動機(jī)能上，追加以面的高度記錄回路，就可以對樣品的表面形狀進(jìn)行非接觸式測定。以此機(jī)能為基礎(chǔ)，對各畫素中zui大輝度值形成的Z軸坐標(biāo)的記錄成為可能，并以此情報為依據(jù)可以獲得樣品表面形狀相關(guān)的情報。
　　10.高精度微小尺寸測定機(jī)能
　　受光單元采用了1維CCD成像傳感器，因此可以不受掃描裝置掃描傾斜等的影響，從而可以完成高精度的測定。另外，由于同時采用焦點(diǎn)深度可調(diào)（加深）的焦點(diǎn)移動記憶機(jī)能，從而可以剔除由于焦點(diǎn)偏移而造成的測定誤差。
　　11.三維圖像解析
　　使用表面形狀測定機(jī)能，可以輕松地做出樣品表面三維圖像。不僅如此，還可以進(jìn)行多種解析如：表面粗糙度測定、面積、體積、表面積、圓形度、半徑、zui大長度、周長、重心、斷層圖像、FFT變換、線幅測定等等。
　　激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測量。