高溫快速消化與國標(biāo)消化的凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量有哪些不同?

1 　方法

1.1 　實(shí)驗(yàn)分組

分為2 組:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。兩組在測定樣本蛋白質(zhì)含量的過程中,采用不同的消化方法,之后的蒸餾、滴定、計(jì)算方法,則*相同。推薦使用儀器：蛋白質(zhì)測定儀（http://www.dsddy.cn/），半自動(dòng)定氮儀。

1.1.1 　對(duì)照組:操作嚴(yán)格按照國標(biāo)規(guī)定〔1〕進(jìn)行。其采用的消化方法為小火碳化消化法:取樣品稀釋液110 mL 與消化劑及硫酸一起加入定氮瓶內(nèi),于瓶口放一漏斗,將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上加熱消化,消化過程要求小火（400 ℃） 碳化3 h 左右。

1.1.2 　實(shí)驗(yàn)組:采用的消化方法是高溫消化法:將樣品稀釋液110 mL 與消化劑一起加入定氮瓶內(nèi)保持1 000 ℃的高溫持續(xù)加熱,其過程要求保持定氮瓶內(nèi)液體沸騰,但所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)氣泡不溢出瓶口,同時(shí)產(chǎn)生的蒸餾水氣體在瓶壁遇冷回流,可以將瓶內(nèi)壁上的蛋白質(zhì)帶回瓶底進(jìn)行消化,整個(gè)消化過程大約1 h。

1.2 　蛋白質(zhì)含量檢測

1.2.1 　兩組方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性比較: 分別對(duì)50 g/ L蛋白校準(zhǔn)液（上海申索） 及15 份人血白蛋白樣品（蛋白含量未知） 進(jìn)行兩種方法的蛋白質(zhì)含量檢測,前者重復(fù)15 次。

1.2.2 　實(shí)驗(yàn)組蛋白回收率檢測（見表1） :任取2 種含蛋白的樣品A、B（蛋白含量未知） ,每種樣品分別取3 份各916 mL ,加入50 g/ L 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0μL 、100μL 、400μL 和分別對(duì)應(yīng)400μL 、300μL 、0μL 的生理鹽水,執(zhí)行4 次重復(fù)試驗(yàn),進(jìn)行2 種方法的蛋白質(zhì)含量檢測。zui后計(jì)算回收率。

1.3 　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以€x ±SD 表示,兩組間結(jié)果比較采用配對(duì)資料的t 檢驗(yàn)及回歸分析。

2 　結(jié)果

2.1 　兩組方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性比較（見圖1）對(duì)50 g/ L 蛋白校準(zhǔn)液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果,國標(biāo)消化法為49.95 g/ L ±0.00 g/ L ,高溫消化法為49.91 g/ L ±0.00 g/ L ,兩種方法無顯著差異（ t= 1.1602 , P > 0.05） 。蛋白校準(zhǔn)液氮含量檢測結(jié)果:國標(biāo)消化法為8.20 g/ L ±0.00 g/ L ,高溫消化為8.21 g/ L ±0.00 g/ L , 2 種方法無顯著差異（ t = 1.000 , P > 0.05） 。對(duì)人血白蛋白樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果,國標(biāo)消化法為97.61 g/ L ±0.57 g/ L ,高溫消化法為97.65 g/ L ±0.55 g/ L ,兩種方法無顯著差異（ t =0.5762 , P > 0.05） 。樣品氮含量結(jié)果:國標(biāo)消化法為15.6 g/ L ±0.01 g/ L ,高溫消化為15.6 g/ L ±0.01g/ L ,兩種方法無顯著差異（ t = 0.8069 , P > 0.05） 。

將兩種方法對(duì)蛋白標(biāo)液和樣品檢測結(jié)果進(jìn)行回歸分析（見圖2） ,得出Y = 0.9987 X + 0.0797 , R2= 0.9999。

 

 

2.2 　實(shí)驗(yàn)組蛋白回收率檢測結(jié)果見表1。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7 %、0.8 %、1.7 %和1.2 %,兩種分別加入0μL 、100 μL 、400μL 、50 g/ L 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的混合樣品回收率分別為:98.0 %、97.5 %、98.0 %和98.5 %,平均為98.0 %。